Der Sohn des Kunstsammlers Heinrich Benesch, einer der ersten und wichtigsten Förderer Egon Schieles, war von Kindheit an mit moderner Kunst vertraut und mit zahlreichen Künstlern persönlich bekannt. Schieles "Doppelbildnis Heinrich und Otto Benesch" (1913) zeigt den väterlichen Freund und Sammler des Malers mit seinem damals 17jährigen Sohn Otto.

Benesch studierte Kunstgeschichte an der Universität Wien und promovierte 1921 mit einer Dissertation über "Rembrandts zeichnerische Entwicklung". Seit 1920 als Volontär an der Gemäldegalerie des Kunsthistorischen Museums in Wien tätig, wechselte er 1923 als Assistent, später als Kustos an die Albertina.

Nach dem "Anschluss" Österreichs emigrierte Benesch über Frankreich nach Großbritannien und 1940 weiter in die USA, wo er als Vortragender an verschiedenen Universitäten wirkte und bei mehreren österreichischen Exilorganisationen mitarbeitete. 1947 folgte Benesch einer Einladung nach Wien, wo er 1948 zum außerordentlichen Universitätsprofessor für Kunstgeschichte ernannt wurde und bis 1962 als Direktor der graphischen Sammlung der Albertina tätig und hier für den Aufbau einer repräsentativen Sammlung moderner Graphik verantwortlich war.

Als Präsident des Dokumentationsarchivs des österreichischen Widerstandes setzte er sich für die aktive Auseinandersetzung mit der NS-Vergangenheit ein.

Otto Benesch wurde in einem Ehrengrab am Hietzinger Friedhof beigesetzt. Der Otto-Benesch-Park in Favoriten wurde 1981 nach ihm benannt.

Werk (Auswahl): Rembrandt, Werk und Forschung, 1935; Österreichische Handzeichnungen des 15. und 16. Jahrhunderts, 1936; The Art of the Renaissance in Northern Europe, 1945; Rembrandt, Selected Drawings, 1948; Kleine Geschichte der Kunst in Österreich, 1950; Die großen Primitiven, 1950; Egon Schiele als Zeichner, 1951; Rembrandt als Zeichner, 1963; Meisterzeichnungen der Albertina, 1964; Kritisches Gesamtverzeichnis der Zeichnungen Rembrandts, 6 Bd., 1964.